作者：中国水产科学研究院南海水产研究所/农业部南海渔业资源开发利用重点实验室 李卓佳 林黑着 杨铿
淮安大江水产饲料有限公司 唐维可 张善夫
摘要：探讨芽孢杆菌对质量为30.68（±2.34）g的草鱼（肠道消化酶活性、血清生化指标的影响。试验随机分为5组，分别饲喂添加0、0.5、1.0、2.0、4.0g/kg益生菌（109CFU/g）的饲料养殖4周，在14d和28d时取样。结果显示，试验组草鱼肠道蛋白酶活性显著大于对照组，各试验组之间差异不显著；而对淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶活性影响不大。试验组草鱼血清酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）活性显著大于对照组；溶菌（UL）活力在14d时提高不显著，在28d时活力显著提高；试验组草鱼总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化物酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化指标显著大于对照组，除个别组外，各试验组之间差异不显著。结果表明芽孢杆菌可以提高草鱼机体消化酶活性、改善理化指标和提高抗氧化能力，增强机体免疫机能。
关键词：草鱼；消化酶；血清生化指标；芽孢杆菌
草鱼是我国主要的经济养殖鱼类之一，在水产经济动物养殖中占有重要地位，在提高人民经济收入方面发挥着重要作用。随着水产养殖业的快速发展，草鱼养殖生态环境不断恶化，养殖病害日趋严重，大量抗生素和化学药品的使用造成致病菌耐药性日益严重，严重影响了水产品品质、人类健康及草鱼产业化的可持续健康养殖。因此，寻找绿色环保的抗生素替代品就成为研究的重点和热点。芽孢杆菌可产生多种消化酶类如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和多种抑菌物质，具有无毒、无残留等优点，被认为是安全有效的有益微生物。而且，芽孢杆菌在储存过程中以孢子体形式存在，能够耐受水产颗粒饲料生产的加工工艺，热稳定性良好。有研究表明，在日粮中添加益生菌既能提高鱼类和虾的消化酶活性，促进生长；又能提高异育银鲫和东方鱼鲀的非特异性免疫功能，增强抗病力。目前，芽孢杆菌在草鱼养殖中的应用多体现在其对草鱼养殖环境生态因子的影响上，对草鱼消化酶活性及生化指标的影响尚未见报道。因此，本试验旨在研究芽孢杆菌对草鱼消化酶活性及血清生化指标的影响，为益生芽孢杆菌在草鱼健康养殖中的推广应用提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
草鱼购自番禺立海养殖场，经过7d的室内过渡驯化暂养后挑选体重30.68（±2.34）g的健康鱼苗进行试验。试验用饲料为豆粕-鱼粉型，制成5组颗粒饲料（粒径1.0mm），芽孢杆菌（109CFU/g）添加量分别为0、0.5、1.0、2.0、4.0g/kg饲料。芽孢杆菌由中国水产科学研究院南海水产研究所提供。
1.2试验方法
1.2.1试验设计与管理
试验鱼随机分为5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼，置于80cm×80cm×70cm水池中养殖4周（2011年4月18日到5月15日），水温、pH值、溶氧、NO2-等指标每天监测1次。投料量按照鱼体重的1%于每天8：00、17：00各饲喂1次，水温27.0（±2.0）℃，pH值7.3~7.9，溶氧7.6~8.2mg/L，NO2-0.01~0.02mg/L。
1.2.2肠胃粗酶液制备试验
第14d、第28d分别每组随机取样6尾鱼（2×3重复），按于书坤等（1986年）的方法将所取样本的胃和肠道剥离后用ddH2O冲洗，用滤纸吸干后迅速称重，捣碎后移入匀浆器内匀浆定容至100mL，在-4℃下离心20min（5000r/min），取上清液备用。
1.2.3消化酶活性测定蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶测定
参照中山大学（1979年）的方法进行。肠蛋白酶活性测定缓冲液pH值为7.2，胃蛋白酶活性测定缓冲液pH值为3.0；在温度37（±1）℃下，每分钟水解酪蛋白（5mg/mL）产生1μg酪氨酸为1个酶活性单位。脂肪酶测定的缓冲液pH值为7.5，在温度37（±1）℃下，每分钟产生1μmol脂肪酸为1个酶活性单位。纤维素酶活性测定缓冲液pH值为4.8，在温度40（±1）℃下，每分钟催化纤维素生成1μg葡萄糖为1个酶活性单位。淀粉酶测定参照上海医学化验所（1979年）的方法进行，缓冲液pH值为6.8，在温度37（±1）℃下，100mL酶液在30min内完全水解10mg淀粉为1个酶活性单位。
1.2.4血清的收集试验
第14d、第28d每组随机取6尾草鱼（2×3重复），麻醉后尾静脉取血，血样静置于4℃冰箱内2h，血液凝固后离心（3500r/min，30min）即可收集上清液血清，-20℃保存备用。
1.2.5血清生化指标检测
（1）溶菌（UL）活力。以溶菌微球菌冻干粉（南京建成生物工程研究所生产）为底物，参考王雷等（1995年）方法。置96孔板于冰台上，加入底物悬液（OD570为0.35～0.45，300μL/孔），再加入5μL血清混匀，于多通道分光-荧光光度计TECANSAFIRE中，设定温度为37(±0.5)℃，在波长570nm下，每2min测量1次，测定各反应体系的吸光值A，共测量15次。溶菌活力UL=(A终值-A初值)/A终值。
（2）酚氧化酶（PO）活力。以L-多巴为底物，采用改进的Ashida方法（1971年）在96孔酶标板中进行。把10μL血清加入96孔酶标板中，再向各孔中加入200μL磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH值6.0），最后向各样品孔中加入10μLL-多巴液（0.01mol/L），在酶标仪（550，Bio-Rad）中振荡3次。在波长490nm下，每4min测定其吸光值。酶活力定义：在试验条件下，OD490每分钟增加0.001为1个酶活力单位。
（3）磷酸酶活力。碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性测定均采用磷酸苯二钠法。AKP以1mL血清在温度37（±0.5）℃下，与底物作用15min，产生1mg酚为1个酶活力单位；ACP以1mL血清在温度37（±0.5℃）下，与底物作用60min，产生1mg酚为1个酶活力单位。
（4）抗氧化指标。总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性等用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测。T-AOC定义为：在温度37（±1）℃下，每1mL血清每分钟吸光度增加0.001为1个酶活性单位；SOD活力定义为：每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应SOD的量为1个酶活力单位；CAT酶活性单位定义为：1mL血清每秒钟分解1μmolH2O2的量为1个酶活力单位。酶液蛋白浓度测定：以标准牛血清白蛋白作为标准，采用考马斯亮蓝G-250染色法。
1.2.6数据处理
试验数据以平均值±标准差表示，采用软件SPSS11.0进行单因子方差分析，Duncan’s多重比较，以P<0.05作为差异显著性标准。
2结果与分析
2.1芽孢杆菌对草鱼消化酶活性的影响
第14d时的检测结果（图1）显示，胃蛋白酶和肠蛋白酶在芽孢杆菌添加量为1.0g/kg时获得最大活性，淀粉酶、脂肪酶在2.0g/kg时获得最大活性。试验组蛋白酶活性显著大于对照组，淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶活性与对照组之间差异不显著，各试验组之间差异也不明显。第28d时的检测结果（图2）显示，试验组胃蛋白酶和肠蛋白酶分别在芽孢杆菌添加量为1.0、0.5g/kg时获得最大活性，显著大于对照组，各试验组之间差异不显著。
淀粉酶和脂肪酶均在芽孢杆菌添加量为1.0g/kg时获得最大活性，试验组和对照组之间差异不显著。除胃蛋白酶外，第28d时检测的肠蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶获得最大活性时的芽孢杆菌添加量比第14d时的添加量小，对纤维素酶活影响不大。28d时各消化酶活性与14d时各消化酶活性之间差异不显著。
2.2芽孢杆菌对草鱼血清生化指标的影响
第14d时的检测结果（图3）表明，PO、AKP、UL分别在2.0、1.0、1.0g/kg芽孢杆菌组活力最大，试验组显著大于对照组（UL除外），各试验组之间的差异不显著。ACP以2.0g/kg组活力最大，略大于1.0、4.0g/kg组，显著大于0.5g/kg组和对照组。
第28d时的检测结果（图4）和第14d时的检测结果表现出相似的规律性。PO、AKP、UL分别在2.0、1.0、1.0g/kg组获得最大活力，试验组显著大于对照组，各试验组之间差异不显著。ACP以2.0g/kg组活力最大，略大于1.0g/kg组，显著大于0.5、4.0g/kg组和对照组，0.5、4.0g/kg组和对照组之间也表现出显著差异水平。28d时各理化指标与14d时差异不显著。
2.3芽孢杆菌对草鱼血清抗氧化能力的影响
第14d时的检测结果（表1）显示：试验组T-AOC显著大于对照组，但各试验组之间差异不显著；试验组CAT和SOD活性均显著大于对照组，除0.5g/kg组外，各试验组之间差异不显著。第28d时检测结果显示：0.5、4.0g/kg组T-AOC和SOD活性和对照组之间差异显著，1.0、2.0g/kg组和对照组之间差异极显著，各试验组之间差异不显著（0.5g/kg组除外）；2.0、4.0g/kg组CAT活性和对照组之间差异显著，0.5、1.0g/kg组和对照组之间差异极显著。在不同的芽孢杆菌含量条件下，随着时间增加各抗氧化指标有增加趋势；除个别指标外，28d时各抗氧化指标较14d时大。
生化指标
图4第28d芽孢杆菌对草鱼生化指标的影响
注：表中同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著，大写英文字母不同者表示差异极显著。
3讨论
3.1芽孢杆菌与肠道消化酶活性
消化酶作为维持机体正常代谢的重要生命活性物质之一，催化调节生物体内各种化学变化，促进机体对饲料的消化，提高饲料利用率。有研究表明，芽孢杆菌可提高对虾消化酶活性，添加量为1.0g/kg饲料时，对虾增重率提高8.2%、蛋白质效率提高13.2%、饲料系数降低9.7%，促进了对虾的生长。本课题组前期研究芽孢杆菌对南美白对虾生长性能及消化酶活性的影响时也得到相似的结果。本试验中，芽孢杆菌可提高草鱼消化酶活性，表明芽孢杆菌的应用有利于机体对养分的消化吸收，这与芽孢杆菌可以提高异育银鲫和三角帆蚌消化酶活性的研究结果一致，与酶制剂对鲤鱼肠道消化酶活性的影响有所不同（叶元土等，1993年）。这可能是由于芽孢杆菌对消化酶活性的影响与酶制剂的影响作用机制不同有关，两者不同的作用机制有待于进一步探讨。芽孢杆菌对消化酶活性的影响可能与芽孢杆菌能产生蛋白酶、淀粉酶等酶类和酶促因子有关，也与芽孢杆菌代谢产生氨基酸、多肽、维生素、微量元素等多种活性物质有关。因为这些活性物质既能补充机体营养又具有代谢活性，参与调节养分在机体内的代谢过程，改善机体生理活动，从而提高宿主消化酶活性。消化酶活性反过来促进机体对养分的消化吸收，改善机体的消化功能。这也成为芽孢杆菌促进机体生长和提高生产性能的重要构成因素。
3.2芽孢杆菌与血清生化指标
鱼虾等低等水生养殖动物在抵抗外来入侵病原菌或条件致病菌的过程中，其非特异性免疫机在清除异物发挥着重要作用。Sritunyalucksana等研究报道，PO具有免疫调节活性，凡纳滨对虾SOD也具有免疫调节活性，可以用来衡量机体免疫力高低。也有研究表明，芽孢杆菌添加量为1.25×104CFU/mL时，南美白对虾的PO、SOD、UL等免疫指标分别比对照组提高3.0、2.6和1.1倍。反映非特异免疫机能的生化指标UL、PO、ACP、AKP等参与构成鱼类抵抗病原的第一道屏障。非活化态的PO原激活系统可以识别外来物并启动或增强与机体抗病有关的反应，激活后（如芽孢杆菌代谢产生的活性成分）生成PO可以催化酚转化为黑色素，抑杀某些病原菌。Chen等报道，虹鳟鱼的非特异免疫水平UL在受到外源微生物侵染时增加，并在10周后表现最大活性。ACP、AKP均是吞噬溶酶体的重要组成部分，在血细胞进行吞噬和包囊反应中，会伴随有ACP的释放。本试验中试验组草鱼的血清生化指标得到改善，这与Harikrishnan等研究芽孢杆菌对牙鲆免疫机能影响及地衣芽孢杆菌对三角帆蚌免疫机能的影响时所报道的结果相似。表明芽孢杆菌对草鱼体液免疫因子产生明显影响，有利于增强草鱼抗病力。
3.3芽孢杆菌与抗氧化能力
研究表明，T-AOC是用来衡量机体抗氧化系统机能状况的综合性指标，反映机体对外来刺激的代偿能力以及机体自由基代谢的状态。Ko等研究报道，饲喂1.5%亚油酸对试验动物SOD和CAT活性产生影响，尤其对CAT影响明显，能清除多余的活性氧和过氧化物，减少自由基对正常细胞的损伤，提高机体抗氧化机能和抗病力。高等动物体内SOD存在CuZn-SOD和Mn-SOD两种，可以清除生物体内超氧阴离子自由基(O2-)，调节机体内的氧化与抗氧化过程，保护细胞免受损伤。在乳酸菌作用下，SOD和谷胱甘肽活性增强，表现出清除机体羟自由基、过氧化氢以及抗脂质过氧化的活性。本试验中，芽孢杆菌对试验组草鱼抗氧化指标的影响作用与地衣芽孢杆菌应用于三角帆蚌养殖，可以提高三角帆蚌的抗氧化能力相似。表明草鱼养殖中应用芽孢杆菌可以提高草鱼的抗氧化效果，但其作用机制还需要进一步研究探讨。